在生物制药行业中，人们常常依据 “经验法则” 来确定清洗设备和管道所需的流量。然而，当为维持供液和回液管道的流速，却导致被清洗设备中液体不断积聚时，这些 “规则” 之间可能会出现矛盾。本文将对 CIP 进行概述，并为确定设备清洗的流速提供依据。
CIP 的目的
在线清洗（CIP）是生物制药行业中的术语，指在无需大量拆解部件的情况下，对工艺系统和设备进行清洗的过程。除了清洗功能外，CIP 还能通过去除氯化物和蛋白质，辅助原位蒸汽灭菌（SIP）操作。若残留氯化物，在加热时可能引发应力腐蚀；而残留的蛋白质在被蒸汽变性后，会 “烘烤” 在设备表面。
CIP 涉及一系列预先设定的手动和自动化操作，以执行清洗、监控操作过程并记录结果。目前最先进的做法是使用一系列专用的 CIP 清洗站，每个清洗站都分配给特定的工艺区域或功能，并配有独立的管道系统。下图展示了一个典型但简化的 CIP 系统，包含相应的仪表和阀门。
一个设计合理的 CIP 系统能够以最少的水、化学品和公用设施消耗，产生最少的废水。它通过减少人为错误来提高安全性、降低维护成本，并通过确保可重复性和最小化操作人员干预，为验证提供文件记录，从而维持产品质量并缩短批次之间的周转时间。
时间
典型的生物制药生产通常是每天 24 小时、每周 7 天不间断运行，称为 “24/7” 模式。CIP 只是典型 8 小时周转（从脏到干净）周期的一部分，该周期还包括 SIP 以及相关的加热、冷却和完整性测试。大部分时间用于 SIP 前后的加热和冷却，但 CIP 所需的时间对于确定所需的 CIP 系统数量至关重要。
工厂验收测试（FATs）一般通过使用核黄素覆盖测试来检验喷淋球的有效性。该测试可确保容器内部被喷淋球充分湿润，但无法保证工厂的 CIP 系统能对罐体进行有效清洗。
固定喷淋球在流量为3 – 5 立方米 / 小时、每个喷淋球的压差为1.7 巴的条件下，30 – 90 秒内即可成功通过覆盖测试（喷淋球的数量由总流量需求决定，后续会讨论）。测试方法是将稀释（0.2 – 0.3 克 / 升）的核黄素溶液喷洒在容器内部，待核黄素干燥后，再用喷淋球去除残留。在规定的时间间隔后，使用紫外线灯检查罐体，以确定核黄素是否已被清除。
理想情况下，每个喷淋球在 3m³/h的流量和 30 秒的时间内即可成功完成测试，这样可以留出安全系数，并且在原始钻孔未达到所需覆盖范围时，还能增加喷淋球上的孔数。
由于清洗的依据是覆盖测试结果，因此在测试时间上乘以 2 – 3 的安全系数，并在 CIP 周期的所有步骤中使用相同的时间。基于每个步骤 5 分钟的六个清洗步骤，再加上设置、吹气、加热和添加化学品的时间，清洗包含一个主要流路（罐体）和几个次要流路（浸入管或输送管）的回路大约需要 90 分钟。
要分析包括 CIP 在内的所有公用设施系统，就需要对多样性进行全面分析。通过进行工艺模拟，来确定公用设施系统的同时使用情况，以确保有足够的供水。该模拟还用于确定同时运行所需的 CIP 单元数量，这将影响操作的多样性以及对去离子水（DIW）和注射用水（WFI）的瞬时需求。
温度
如果存在蛋白质，预冲洗应在常温下进行，以尽可能多地去除蛋白质，同时避免其变性。后续的冲洗和清洗则应在较高温度下进行，一般为60 – 82°C，以提高其他类型污染物的溶解度。通常使用卫生型蒸汽加热的管壳式换热器来升高温度。
溶液浓度和类型
除了最后的 WFI 冲洗外，冲洗和清洗通常使用常温的 DIW。预冲洗后，其他溶液将被加热到60 – 82°C。应根据洗涤剂溶解残留物的能力以及自身被去除的难易程度来选择洗涤剂。碱性清洗液通常配制成 1 – 2% 的苛性碱浓度，而酸性清洗液的酸浓度可能略低，通常为磷酸，用于中和残留的苛性碱，并去除碳酸钙和碳酸镁沉积物。
使用相当宽泛的化学浓度范围都可以获得令人满意的清洗效果。然而，如果要使用不同浓度的清洗溶液，则必须在预期的浓度范围内验证其有效性。
溶液可以由市售的（通常为食品级）碱和酸配制而成，也可以从专门生产生物制药设备清洗液的公司购买专用溶液。
设备的表面特性
长期以来，关于抛光表面与轧光表面相比是否具有优势一直存在争议。支持使用轧光表面的人认为，微观划痕会为蛋白质和其他污染物的附着提供表面。虽然对于机械抛光来说可能确实如此，但对于电解抛光而言并非如此，因为电解抛光产生的亚微观 “划痕” 过于狭窄，污染物无法隐藏其中。
内部表面处理
清洗是一个化学过程，而非机械过程。由于尽量减少机械力和 / 或化学作用对表面造成的降解至关重要，因此在清洗表面时，应施加足够但不过量的化学浓度、温度和作用力。
典型的生物制药设备表面处理是经过电解抛光的 316L 不锈钢，平均粗糙度（Ra）约为0.38 微米。这是通过将轧光表面机械抛光至最大表面粗糙度为0.6 微米，然后再进行电解抛光实现的。电解抛光不仅能使表面更加光滑，还能减小微观峰谷之间的差异。电解抛光后，表面粗糙度通常会降低 50%，达到 15 微英寸，但峰部的平滑处理比实际的 Ra 值更为重要。
除了表面处理外，还必须仔细关注浸入管、搅拌器联轴器、挡板附件和喷嘴连接等细节，消除死角和盲端，提供光滑、无缝隙的接头，并使设备能够自动排水。
流速 / 湍流
罐体
如果喷淋球针对特定应用进行了合理设计，那么它在清洗罐体等设备时非常有效。由于清洗是通过喷淋 / 溢流 / 浸泡（化学）作用而非机械（冲击）力来实现的，因此低压喷淋通常就足够了。喷淋球的作用是将清洗液和冲洗液分布到罐体顶部，通过喷淋和降膜的组合湿润所有表面，并使化学反应得以发生。可能需要在较低位置添加一个可拆卸的喷淋球，以清洗搅拌器、气体分布器或位于罐体下部的侧面安装喷嘴，但通常情况下，顶部安装的喷淋球就足够了。顶部喷淋球应至少位于最高液位上方 6 英寸处，以避免在不使用时工艺流体进入喷淋球并堵塞喷孔。尽管一些制造商声称他们模拟罐顶并在喷淋球上钻孔，使孔对准特定的喷嘴，但现成的喷淋球通常能提供足够的覆盖范围，大约每1 – 1.5 平方米的横截面积配备 1 个喷淋球。
喷淋球的规格通常为每个3 – 5 立方米 / 小时，压差为1.7 巴。其性能通常基于覆盖测试。覆盖测试计划应基于较低的流速制定，以提供灵活性。如果在测试过程中未获得完全覆盖，可以在不影响允许压降的情况下额外钻孔。不建议增加压力，因为这可能会导致雾化，这是不利的，因为小液滴需要额外的时间聚结并在罐壁上形成清洗液膜。
最好同时操作多个喷淋球。由于离心式供液泵的流量 – 压力特性，为回路中的所有路径设计相同的流速非常重要。这可能需要将流量分配到各个喷淋球。如果是这种情况，应每隔 30 秒左右在多个路径之间进行切换，以确保对内部部件提供相对一致的覆盖。
通过要求沿罐壁流下的流体膜的雷诺数大于 2100，可以估算出清洗罐体的 CIP 流速。在《化学工程原理》中，研究表明，在给定的膜粘度、质量流量和湿润周长的情况下，无论圆柱体是否充满，雷诺数 Re₁都是相同的。
这种关系表明，与冷流体相比，要达到相同的覆盖效果，所需的热流体量要少得多。例如，水在80°C时的粘度是0.35厘泊 ，在环境温度下是1.0厘泊。按绝对值计算，对于一个7英尺直径的容器，进行一次冷冲洗需要5.5立方米/小时的流量，而进行一次热冲洗则仅需1.7立方米/小时 。
管线
扩散和对流是清洗动力学的控制因素，这表明清洗管道的直管部分时，并不一定需要湍流。然而，湍流可以增加流体向表面的移动，使溶剂能够与蛋白质或其他污染物混合并发生反应，同时还有助于将反应后的混合物从表面移走。
对于管径大于 1 英寸的管道，0.2 米 / 秒的流速足以实现湍流。然而，其他因素也可能影响合适流速的选择。例如，流速必须大于颗粒的沉积速度，以去除较大和较重的颗粒；并且流速要足够高，以便在管道的一部分不能自动排气时夹带气泡。管道主路中的较高流速还能在遵循最大距离标准时，更好地使清洗液流入死端支路进行清洗。因此，3A – 乳制品标准传统上建议（并非强制要求）的1.5m/s的流速似乎是合理的。当流体依次流经不同直径的管道时，该流速应基于最大管径来确定，但如果管径变化超过一个规格，应将回路分开，以适应为实现相似流速所需的不同流量。
清洗设计
管道
不应使用螺纹连接和法兰连接，因为污染物可能会积聚在螺纹或法兰与垫圈之间的间隙中。理想情况下，系统应完全采用焊接连接。
回液管道应尽可能设置较大的坡度（最好为 2%，但最小不得低于 1%），这既有助于重力排水，又能防止形成气穴，避免清洗液无法到达待清洗表面。在设计和制造过程中，必须通过牢固支撑管道来消除管道中的凹槽，以保持所需的坡度。
支路与回液总管的连接应尽量减少死端。死端和凹槽会残留污垢甚至清洗化学品，这将延长清洗周期，或者需要额外的冲洗或清洗液，从而增加工厂废水以及 DIW 和 WFI 的使用量。
管道应单独或串联进行清洗。不要尝试并行清洗管道，因为很难确保每条路径都能达到最低流速，而且一条路径中的液体可能会倒流到另一条路径中，实际上阻碍清洗过程。
CIP 系统与工艺之间不应设置永久性连接，应使用转接面板、软管或防混阀来建立和断开连接。在转接面板和软管处使用卫生夹式连接，对于很少打开的连接使用螺栓连接，对于经常打开的连接使用蝶形螺母连接。
使用接近开关或卫生型压力表来确认路径，防止 CIP 回路出现误操作和 / 或不安全操作。
CIP 清洗站
CIP 清洗站通常包含一个用于冲洗和存放化学溶液的罐。它也可能配备一个专门用于最后冲洗的 WFI 罐，或者 WFI 由一个公共罐提供，为多个 CIP 清洗站服务。循环泵、热交换器、化学品日用罐以及管道和控制系统共同构成了清洗站。罐体内应设有分离返回清洗站的空气的装置。由于 CIP 罐可能是系统中最脏的部分，因此应对其进行清洗（喷淋）。
如果原位清洗（CIP）集成装置靠近工艺设备使用点，回流泵可安装在该装置上，但通常是由靠近工艺设备的泵来实现这一回流功能。应监测泵的压力和流量，以确认循环速率。
过滤器
由于过滤器难以排水，可能需要在清洗时将滤芯取出并可能丢弃，然后在灭菌前安装新的滤芯。
积液
设备和管道应能够自由排水，以避免出现 “浴缸环” 效应。即使底部的喷嘴和阀门尺寸较大，也需要压差驱动力来克服动态损失。回液管道通常尺寸较小，以满足最低流速要求。这将导致罐体内积液，并且污垢有可能在气液界面处积聚。应根据阀门数据和适当的工程公式来确定出口喷嘴和管道的尺寸，以尽量减少积液。
如果目标罐内出现积液，供液罐可能会排空并停止清洗循环，直到积聚的液体回流到供液罐。发生这种情况时，循环时间会延长，从而对清洗循环的可重复性产生不利影响。与其增加清洗化学品的用量（这可能需要更多的冲洗量并增加废水排放量），更好的方法是消除罐体出口处的阻力。
喷淋球和管道尺寸标准的综合结果如表所示。
可以对工艺罐进行加压，以提供克服出口喷嘴和阀门阻力所需的压头，但很难控制压力使液位恰好保持在出口喷嘴入口处。如果压力过低，仍然会发生积液；如果压力过高，则会夹带更多空气，这将降低回液管道的输送能力，并可能影响清洗效果。
有人建议通过启动和停止 CIP 进料泵来消除积液，但这只会使积液在罐壁上上下移动，无法从根本上解决问题。而且，如果系统持续启停，还需要一个复杂的控制系统来跟踪清洗时间。解决办法是使用回液泵来克服罐体出口的阻力。
CIP 系统
在工厂中，最好对所有 CIP 系统采用统一的设计理念。这将避免操作失误，确保控制系统配置一致，并保持 CIP 系统与用户之间的文件记录格式统一。
从投资成本的角度来看，一次通过式系统是成本最低的系统，但从运行成本的角度来看却是最高的，因为化学溶液配制、加热后就被直接排放掉了。
一些系统使用自吸泵或喷射器来辅助回收和循环清洗液，可能还包括一些冲洗液，以尽量减少化学品消耗、公用设施使用和废水排放。将回液泵安装在靠近工艺设备的位置也有助于改善排水效果。最后一次冲洗液可以回收用于下一个循环的预冲洗，也可以不回收。
喷射器系统单独或与泵结合使用喷射器来辅助循环，并配制化学溶液。它们可以抽真空并去除夹带的气穴，与泵送回流相比可能更具优势，因为它们不会出现气蚀现象。而且，由于无需考虑净正吸入压头（NPSH）的要求，喷射器系统能够提供比泵送系统更大的驱动力。不过，喷射器可能会因闪蒸流体或夹带的空气而发生气缚现象。
使用低速自吸泵的泵送系统比喷射器系统具有更高的流量和更小的管道直径。泵送系统的优势在于可以将泵安装在目标罐处，以避免积液。泵送系统和喷射器系统在流体温度较低时运行效果更好，因为此时流体的蒸汽压较低。
由同一CIP系统供应的多个回路应设计为相同的运行流量。如果使用同一系统以不同流量清洗大型和小型设备，管道系统中很可能会违反最低和最高流速标准。可以通过分配喷淋球的方式来平衡系统，使喷淋球单独、成对使用，甚至在任何时候三个中有两个打开，从而使回路中的所有路径都使用相同的流量。
CIP 循环
在 CIP 循环的每个阶段，每个运动部件的操作顺序应与正常运行时相同。这包括阀门、搅拌器和泵，以确保每种流体依次接触所有表面。通常，在 CIP 循环的每个步骤中，每个运动部件会运行 5 – 6 次，每次运行 35 秒。
为了尽量减少废水排放并降低化学品用量，可以对部分冲洗液进行循环利用。例如，冲洗液可以先排放 1/3 – 1/2 的规定时间，然后再循环剩余时间。此外，剩余的冲洗液可以作为配制苛性碱和酸液的起始液。
CIP 系统既能去除污染物，又能为设备的蒸汽灭菌做准备。本文不讨论 “污垢” 的性质以及用于去除污垢的化学品，下表简要列出了典型哺乳动物细胞培养工艺中使用的清洗溶液。
| 介质 | 作用 |
| Water – 1st rinse | 大量去除污染物 |
| Base with Hypochlorite | 溶解蛋白质并使其变性 |
| Water – 2nd rinse | 去除碱液和碎屑 |
| Acid | 中和碱液；溶解矿物盐；钝化 |
| Water – 3rd rinse | 去除酸液和碎屑 |
| WFI Rinse | 去除所有残留污染物 |
| Steam | 杀灭病原体 |
CIP循环的典型步骤如下：
预冲洗
预冲洗使用新鲜、清洁的冷水（通常为 DIW），也可以重复使用上一次的最终冲洗液。预冲洗用于去除残留的工艺流体和碎屑。应选择合适的流体和温度，以避免蛋白质变性和沉淀。如前所述，这一步骤可以是一次通过式，然后进行循环冲洗。
循环碱性清洗
残留的冲洗水可以加热，并加入苛性碱或其他洗涤剂，配制成碱性（通常为 1 – 3% 苛性碱）清洗液。这一步骤利用碱性清洗液使残留的蛋白质变性并溶解。虽然变性会增加污垢负载，使蛋白质更难去除，但大部分容易去除的蛋白质应在预冲洗步骤中已被去除。如果未达到预期的清洗效果，通常延长这一步骤的时间会最有帮助。市场上有用于碱性和酸性清洗的专用化学清洁剂。这些混合物可能包含多种化学物质、洗涤剂、氯或其他添加剂，以增强清洗效果。在化学清洗后进行吹气操作，可最大程度地去除化学品，使后续的冲洗更容易。
热冲洗
这一步骤用于去除碱性物质和其他污垢。此步骤不能去除（溶解）更多的蛋白质，可以进行循环冲洗或一次通过式冲洗。
循环酸化清洗
如有必要，使用酸性清洗液来中和残留的碱，溶解剩余的污垢（无机物），去除矿物质沉积物，并对表面进行钝化处理。这一步骤有时可以省略，并且可以用上一步骤的残留冲洗液来配制酸性清洗液。
热冲洗
用热的 DIW 冲洗去除残留的酸以及在酸性清洗中松动的任何其他污垢。这一步骤的冲洗液也可以进行循环。
最终冲洗
最终冲洗使用注射用水（WFI）去除之前清洗残留的痕迹。通过监测 pH 值、电导率或电阻率（与进水对比）来确保清洗效果，这些指标用于测量化学溶液的残留情况，但无法检测蛋白质残留。
控制
一些公司认为手动 CIP 程序更易于验证，因为控制系统不参与验证过程。然而，当前的控制系统在正确实施的情况下，相比手动系统具有诸多优势，或许理想的情况是手动控制与自动控制相结合。控制系统应易于监测、控制和验证，这一点至关重要。
自动化 CIP 是实现可重复清洗的最稳定方法。使用控制系统可确保每次执行 CIP 时都能达到循环、时长和顺序目标。
主要的控制要素包括时间、温度和流速。通常通过监测冲洗电导率来验证清洗效果。进行测量并记录数据，以确认达到了与清洗目标相符的可接受公差范围。化学溶液浓度的典型操作公差为 1 – 3%，温度精度应控制在 ±3°C以内，流速变化不得超过 ±10%。
控制系统的主要功能是控制阀门开闭，并在清洗循环的每个步骤中使回路内的旋转设备循环运行 5 – 6 次。与过程控制系统进行通信至关重要，这样才能协调过程回路中路径的循环与 CIP 步骤的变化，确保各项操作在所需的时间、合适的温度和成分条件下进行。其他控制功能还包括化学品添加速率、浓度控制和温度控制。
一旦采用了控制系统，就必须考虑出现偏差时应采取的措施。一种可能的偏差是由于软管泄漏等故障，外部要求停止系统运行。另一个常见问题是 CIP 清洗站某个罐内液位过低，此时回路必须切换到循环模式以避免损坏泵。CIP 系统的状态通常可分为三到四种：
- 正常状态：目标回路控制阀门对相关路径进行清洗。
- 配制状态：目标回路的主路径打开，用于加热和添加化学品。
- 保持状态：排水阀关闭以防止化学品流失，阀门停止循环，CIP 可编程逻辑控制器（PLC）中的定时器暂停，直到系统恢复到正常状态。该状态可能与配制状态相同。
- 中止状态：系统未能达到预设的安全位置。
控制系统应用于验证清洗效果。除了上述控制功能外，系统还应记录每次清洗操作的结果。
验证
为了验证 CIP 系统，需要有书面文件规定清洗每台设备、每个回路和流路的程序。还需制定其他程序，以量化工艺所需的清洁度标准、确定测量清洁度或残留量的方法以及确认测量结果的分析方法。描述 CIP 验证程序的方案必须经过技术专家的审核、批准并执行。
