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解码发酵工艺:溶解氧的控制要义

在发酵工艺运行的整个流程里,每一个环节都如同精密仪器中的齿轮,相互咬合、协同运作。而其中,氧需求犹如这台仪器的动力核心,对发酵过程的优化起着无可替代的关键作用。它不仅是好氧性微生物生长发育与代谢活动的必需物质,更深深影响着发酵液中微生物的反应进程、代谢产物的积累以及整个发酵周期的长短。

溶解氧的控制

好氧性微生物的生长发育和代谢活动都需要氧气,因为好氧性微生物只有在氧气存在的情况下才能完成生物氧化作用,因此,供氧对需氧微生物是必不可少的,在发酵过程中必须供给无菌空气,才能使菌体生长繁殖积累所需要的代谢产物。而需氧微生物的氧化酶系存在于细胞内原生质中,因此,微生物只能利用溶解于液体中的氧。

为什么微生物只能利用溶解于液体中的氧?

需氧微生物的氧化酶系存在于细胞内原生质中。这就好比一个个“小工厂”(氧化酶系)在细胞原生质内等待“原料”(氧气)来进行生产(生物氧化作用),而这些“小工厂”无法直接接触气相中的氧气。只有溶解在液体中的氧气能够进入细胞原生质,到达氧化酶系,从而参与生物氧化过程,为微生物的生长和代谢提供能量等支持,所以微生物只能利用溶解于液体中的氧。

气相的氧不能直接被微生物利用,主要有以下原因:

微生物细胞结构限制:微生物细胞具有磷脂双分子层构成的细胞膜,其具有选择透过性,只允许特定的小分子物质通过,而气相氧是气体分子,难以直接穿过细胞膜进入细胞内部到达氧化酶系,进而无法参与生物氧化过程。

缺乏有效运输机制:微生物体内没有专门的气体运输载体蛋白等运输机制来摄取和运输气相氧,而水中的溶解氧则可通过扩散等方式进入细胞。

环境条件影响:在微生物生存的自然环境或发酵环境中,气相氧与微生物细胞之间存在气液界面等物理障碍,气相氧需先溶解于液体环境形成溶解氧,再以溶解状态与微生物接触并被利用。

(1)溶解氧和微生物的耗氧

溶解氧(dissolved oxygen,DO)是指被好氧性微生物吸收消耗,并直接参与生长代谢过程的氧气,其作为环境因素对微生物反应有直接影响。溶解氧的大小是发酵控制的一个重要标志,发酵液中溶解氧的多少一般以溶解氧系数Kd值表示。

氧的饱和浓度是指当气体和溶液接触一定时间后,气体分子在气-液两相中的浓度。此时浓度达到动态平衡,溶解到溶液中的气体分子数等于逸出溶液的气体分子数。若外界条件不变,气体在溶液中的浓度就不再随时间而变化,此浓度为饱和浓度或平衡浓度。氧的饱和浓度单位:mmol O₂/L,mg O₂/L,ppm (10⁻⁶)或atm。

影响饱和浓度值的因素有以下3个。

① 温度:随着温度升高,气体分子运动加快,使饱和浓度下降。当纯水与一个大气压的空气相平衡时,温度对氧饱和浓度的影响也可用下列经验公式来计算(适用温度为4~33℃);

C*=14.68/(31.6+t)

式中,C*为与latm空气相平衡的水中氧的饱和浓度,mol/m³;t为溶液的温度。

②溶液的性质和种类:气体在不同性质的溶液中的溶解度是不同的。通常溶质浓度越高溶解度越低。

③氧分压:在系统总分压小于5atm的情况下,氧的溶解度与总压和其他气体的分压无关,

只与氧分压成直线相关,可用Henry定律表示:

C*=Po₂/H

式中,c*与气相po₂达平衡液中的氧浓度,mmol/L;po₂ 为氧分压,Pa;H为Hen-ry常数(与溶液性质、温度等有关),Pa・L/mmol O2。

气相中氧浓度增加,溶液中溶氧浓度亦随之增加,必要时可向发酵液中通入纯氧以提高溶氧。

微生物的耗氧量通常以摄氧率(oxygen utilization ratio OUR)和比耗氧速率两种方法表示。摄氧率是指单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量,记作ro₂[mmol/(L·h)],ro₂值因微生物种类、代谢途径、菌体浓度、温度、培养液成分及浓度的不同而异,其范围一般在25~ 100mmol/(L.h)。

比耗氧速率是指相对于单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量,也称呼吸强度;用Qo₂表示[mmol/(g・h)],Qo₂值因菌种和反应条件而异,一般在1.5~15mmol/(g.h)。

溶解氧的控制

在分批培养中,ro₂和X(X表示微生物菌体浓度)随时间而变化,Qo₂也随时间变化。在对数生长期的后期,ro₂达到最大值ro₂.max 。由 ro₂.max和稳态下Xst可求得 Qo₂.max。

在恒化器连续培养的定常态下,rO₂可表示为:rO₂=QO₂X,由于QO₂是μ的函数,而μ是底物(如O₂)的函数,因此微生物的QO₂与培养液中的[DO]的函数关系可表示为:

QO₂= QO₂,max [DO] / (K + [DO])

式中,K为表观米氏常数。

微生物的耗氧速率受发酵液中氧的浓度的影响,各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求,这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”。以[DO]cri表示。

当不存在其他限制性基质时,如果溶氧浓度高于该值,细胞的比耗氧速率保持恒定;如果溶氧浓度低于该值,细胞的比耗氧速率就会大大下降。

在好氧微生物反应中,一般取[DO]>[DO]cri以保证反应的正常进行。通常情况下,微生物的临界氧浓度大约是饱和浓度的1%~25%。

(2)影响微生物需氧量的因素

不同的微生物其需氧量不同。同一种微生物的需氧量也随菌龄和培养条件不同而异,菌体生长和形成代谢产物的耗氧量也往往不同。影响微生物需氧量的因素主要包括如下几个。

①微生物种类

种类不同,其生理特性不同,代谢活动中的需氧量也不同。

②培养基的组成与浓度

培养基的组成对菌种的需氧量有显著的影响,碳源的种类和浓度影响尤为显著。一般来说,在一定范围内,需氧量随碳源浓度的增加而增加。

③菌龄不同

菌种需氧量情况各异,同一菌种不同菌龄,其需氧程度也不同。一般菌龄低者,呼吸强度高。例如,菌龄为24h的产黄青霉呼吸强度最高。

④培养条件

主要指菌体培养的pH值和温度等。一般温度愈高,营养越丰富,临界值也相应越高。

⑤有毒产物的形成及积累

CO₂是菌体代谢产生的气态终产物,它的生成与菌体的呼吸作用密切相关。CO₂在水中的溶解度是氧的30倍,因而发酵过程中不及时将培养液中的CO₂排出,势必影响菌的呼吸,进而影响菌的代谢。

(3)控制溶解氧的重要性

在生物反应过程中,微生物只能利用溶解状态下的氧(有报道在气-液界面处的微生物也能直接利用气相中的氧,此处不做考虑)。而氧是很难溶解的气体,在25℃、100MPa下,空气中的氧在水中的溶解度为0.25mmol/L。

发酵液中含有各种成分,其溶解度更低,同时由于微生物在人工环境内比较集中,浓度大,不断消耗发酵液中的氧,因此,在发酵过程中必须采用强化供氧。

近年来,许多好氧性发酵已发展到如此地步,以至氧的需求超过现有的生物反应设备的氧传递的能力,其后果是氧传递速率成为产量的限制因素。

愈来愈多的事实表明:氧的供应不足可能引起生产菌种的不可弥补的损失,或可能导致细胞代谢产生所不需的化合物。由于菌体的新陈代谢与有氧呼吸有关,调节通风和搅拌可影响发酵周期的长短和代谢产物的产量。

而了解菌体生长阶段和代谢产物形成阶段的最适需氧量,就可能分阶段且合理地供氧。因此,溶解氧的控制极其重要。

事实上发酵液中氧的浓度并不需要达到饱和,只要维持在氧的临界浓度以上即可。因此,应尽可能了解发酵过程中菌的临界氧浓度和达到最高发酵产物的临界氧浓度,即菌的生长和发酵产物形成过程中的最高需氧量,以便分别合理地供给足够氧气。

此外,还应考虑采用经济有效的方法使发酵液维持所需的溶解氧浓度。通常搅拌可增加通气效果,并且通气本身也具有搅拌作用,因此,发酵过程中的通气和搅拌通常被认为是一个非常重要的操作。

综上所述,在发酵过程优化中,溶解氧的控制举足轻重。它如同发酵生产系统中的“隐形指挥家”,影响着微生物的生长、代谢和发酵产物的形成。准确把握和合理控制溶解氧浓度,采用合适的供氧、搅拌等操作手段,是保障发酵生产高效稳定进行的关键,也是实现优质发酵产品产出的重要保障。

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